动物细胞培养基本技术

动物细胞培养基本技术


一、动物细胞培养基本概念

动物细胞培养是指从人及动物体内取出细胞或组织摹拟体内环境,在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下,使其生长繁殖,并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。在生命科学研究中广泛应用的是外周血淋巴细胞以及来自于皮肤、各个脏器通过一定的处理方法建成的不同组织来源的、能在体外长期生长的细胞系/细胞株。

二、细胞培养所需环境

细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。

1、无污染环境

培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时,与体内相比细胞失去了对微生物和有毒物的防御能力,一旦被污染或自身代谢物质积累过多等,可导致细胞死亡。因此在进行培养中,保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等,是维持细胞生存的基本条件。

2、恒定的温度

维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度。细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强,温度上升不超过39℃时,细胞代谢与温度成正比;细胞在39-401小时,即能受到一定损伤,但仍有可能恢复;在40-411小时,细胞会普遍受到损伤,仅小半数有可能恢复;41-421小时,细胞受到严重损伤,大部分细胞死亡,个别细胞仍有恢复可能;当温度在43℃以上1小时,细胞全部死亡。

3、气体环境

气体是细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH值。大多数细胞的适宜PH7.0 -7.4,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些,在偏酸环境中更利于细胞生长。细胞培养液PH浓度的调节最常用的为加NaHCO3的方法,因为NaHCO3可供CO2,但二氧易于逸出,故最适用于封闭培养,而羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)因其对细胞无毒性,也起缓冲作用,有防止PH迅速变动的特性而用于开放细胞培养技术中,其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的PH值。

4、动物细胞用培养基

培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质,也是细胞赖于生长的生存环境。培养基的种类很多,按其来源分为合成培养基和天然培养基。

1)合成培养基:合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等。单独使用合成培养基只能维持细胞的生存不能促进细胞的增殖。

2)天然培养基:常用的天然培养基有血清、 BSA、某些多肽以及各种生长因子,这些物质能促进细胞生长和增值。最普遍使用的是牛血清。牛血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培养基合用,能使细胞正常增殖生长。常见使用量为5-20%,超过20%对细胞有毒性,会导致细胞死亡。


三、常用设施设备及培养器皿

1.常用设备设施

1)超净工作台:也称净化工作台,分为侧流式、直流式和外流式三大类。

2)培养箱:有普通培养箱和二氧化碳培养箱两种,培养细胞最好配备二氧化碳培养箱。

3)倒置显微镜:有普通倒置显微镜和荧光倒置显微镜两种,一般的细胞培养配置普通倒置显微镜即可。

4)离心机:低速离心机即可。

以上四种是进行细胞培养必备的设备。

5)菌化工作间:一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置冰箱、冷藏柜及消毒好的无菌用品等。

6)操作间:普通培养箱、离心机、水浴锅及日常分析处理物品。

7)清洗消毒间:烤箱、消毒锅、清洗器等。


2.培养器皿

器皿应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品和一次性塑料培养瓶//板等。常用的器皿有以下几种。

1)液体储存瓶:用于储存各种配制好的培养液、血清等液体。

2)培养瓶:根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异,用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀,便于细胞贴壁生长和观察,瓶口要大小一致,口径一般不小于25px,允许吸管伸入瓶内任何部位,规格有200ml100ml50ml25ml10ml等几种。

3)培养皿:用于开放式培养及其它用途。分直径30mm60mm120mm等几种。

4)吸管:常用的有刻度吸管和巴氏吸管两种,吸取少量液体时也可用一次性枪头代替。

5)离心管:离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿之一。

6)其它:如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器、过滤器等。


四.传代细胞培养的基本方法。

传代细胞培养主要有三个基本步骤:传代、冻存和复苏,只要熟练掌握这三个步骤即可顺利完成常规的细胞培养。

1. 细胞的传代
试剂与器皿
●PBS液,0.25%胰蛋白酶,0.02%EDTA,培养液(含10%FBS),青、链霉素(100U/ml),5.6%NaHCO3
●培养瓶/皿/板、移液管(5m1及10m1)、巴氏吸管、离心管、枪头、废液瓶等。
方法与步骤
(1)选已生长至对数生长期,也就是通常说的生长到80-90%汇合的细胞一瓶,轻轻摇动培养瓶几次,悬浮起浮着在细胞表面的碎片,然后连同生长液一起吸出,加3ml(625px
2瓶)PBS洗一次。
(2)从无细胞面加入0.25%胰蛋白酶液或胰蛋白酶一EDTA消化液1ml,放于37℃培养箱中1-3分钟,翻转培养瓶,使消化液浸没细胞30s- 1min,显微镜下观察细胞,若细胞大部分变圆,即可拿到超净台内,对于一般的肿瘤细胞,消化液可吸出也可不吸出,沿细胞面加入新配制的生长液,按10ml/瓶的量加入,洗下细胞,并用吸管轻轻吹打数次,使细胞分散开,按1:2或1:3......分瓶传代;如为原代正常的上皮细胞、内皮细胞等对胰酶敏感的细胞,必须迅速加入完全生长液终止消化液的作用,以免酶的作用时间过长而损伤细胞膜,导致细胞死亡,之后收集到离心管中以1000rpm/min离心5min洗去消化液后再按上述方法分瓶传代培养。
(3)放于37℃,5%CO
2培养箱中培养,一般细胞接种后30min左右可贴壁,24小时可换生长液,也可不换直到3—4天后长成单层,长成单层后必需传代或供试验用,如果暂时不用,可冻存长期保存。

2. 细胞冻存

(1)收集细胞:当细胞生长达对数生长期时,常规消化液分离细胞后收集到离心管中,细胞计数,1000rpm/min离心5min,弃上清。

(2)配冻存液:90%完全培养液,5-10%DMSO。现用现配。

(3)分装细胞:一般冻存细胞的数量是每支2ml冻存管1-2x106个细胞,按此标准加配好的冻存液把细胞悬浮起来,分装到灭菌的冻存管中,每支冻存管放1-1.8ml,通常我们是放1ml,这样复苏细胞时解冻快,细胞活力更高。

(4)标记:这一步很重要,在冻存管标签处写明细胞株名称、传代数、冻存日期等重要信息。

(5)冻存:如果有冻存盒,把分装、标记好的冻存管放进冻存盒,直接放到-80℃超低温冰箱过夜;没有冻存盒,可直立放于泡沫盒内以4℃ 30min,-20℃30min,-80℃过夜这个程序冻存。-80℃过夜后可移到液氮灌长期保存。如果短期内要使用,可不移入液氮中保存,但时间不要超过3个月。

3. 细胞复苏

(1)准备一37℃的水浴锅,把需复苏的冻存管从液氮中取出来,立即投入37℃水浴中,轻轻摇动,待液体都融化后(不要超过2分钟),拿出来喷洒75%酒精放到超净工作台内。

(2)把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中(用培养基把冻存管洗一遍,把粘在壁上的细胞都洗下来),1000rpm/min离心5分钟。

(3) 把上清液吸走,加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的培养瓶/板/皿中轻轻摇动,使细胞均匀分布。

(4)标记好细胞株名称和日期、培养人名字等,放到37℃,5%CO2培养箱中培养。

(5)第二天倒置显微镜下观察细胞生长情况,若细胞贴壁汇合不到80%就换培养基;若细胞已长至80-90%汇合时就可以传代。


五.微生物污染及处理

由于体外培养的细胞自身没有抵抗污染的能力,而在培养基中加抗生素的抗污染能力也是有限的,因而细胞微生物污染一旦发生往往是无法挽救的。一般在细胞受到污染早期或污染较轻时,能及时处理并除去污染物,部分细胞还有可能得到挽救。但当细胞持续在污染环境中生长时,轻者细胞生长缓慢,细胞变得粗糙,轮廓增强,胞浆中出现较多的颗粒物质;较重的细胞增殖停止,细胞变圆或崩解,从瓶壁脱落。

不同的微生物污染物对细胞的影响也有差别,微生物中支原体和病毒对细胞形态和技能的影响是长期的,缓慢的和潜在的。而霉菌和细菌增殖迅速,能在很短的时间内抑制细胞生长或产生有毒物质杀灭细胞。

霉菌污染

表现:真菌的种类很多,污染的多是曲霉菌,白色念珠菌,酵母菌,黑霉菌,孢子菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成淡黄色或是白色的漂浮物,一般肉眼可见,较易被发现,短期内培养液多不变混浊。倒置显微镜下可以看见细胞之间有纵横交错穿行的丝状,树枝状或管状菌丝,并漂浮在培养液中。很多菌丝在高倍镜下可以看见链状排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圆形,散在细胞上及细胞周边生长。

处理:首先,需确定污染物是细菌、真菌、支原体,还是酵母。如果确认是霉菌污染,尽快把污染细胞与其它细胞系隔离开,同时需要对实验过程中所用的器材和试剂做处理,最好高压灭菌后扔掉。对于轻微的污染而细胞较珍贵可用高浓度的抗霉菌抗生素处理试试。但高浓度的抗生素都可能对细胞或细胞系有毒性作用,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

1)在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。

2)分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.250.501.02.04.0,8.0 mg/ml

3)每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆。

4)确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度23倍浓度的抗生素的培养液培养细胞23代。

5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

6)重复步骤4

7)在无抗生素的培养基中培养46代,确定无污染。

细菌污染

细菌污染较常见的有大肠杆菌,白色葡萄球菌,假单孢菌等。加用抗菌素的培养液可预防和排除个别一般少量细菌的污染。一旦发生细菌污染很容易发现,多数情况下培养液短时间内变黄,表明有大量酸性物质产生,出现明显浑浊现象;有时静置的培养液起初不混,但稍加震荡,就有许多混浊物漂起。倒置显微镜下观察,可见培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮,有时在细胞表面及周围有大量细菌存在,细胞停止生长并有中毒表现。必要时可取少量培养液涂片染色检查以明确细菌种类;有的培养液改变不明显而有疑似污染,亦可向肉汤培养基内地入少量培养液,37度培养以检测。

处理:一般用抗生素的常用量的5~10倍作冲击疗法,用药24~48小时后再换常规培养液,有时在早期污染时此法有效。细胞培养中用抗生素多为预防细菌污染,一半多联合应用。一旦发生污染后再使用抗生素常常难以根除,有的抗生素只有抑菌作用而无杀菌效应。

支原体污染

   支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。自然界分布广泛,种类多,有80余种,分为两个属:一为支原体属(Mycoplasma),有几十个种;另一为脲原体(Ureaplasma),仅有一种。支原体无细胞壁,多呈不规则球状、长丝状,可分枝,营寄生共生或腐生生活。一般侵害对象为动植物,可造成多种疾病。与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。培养的细胞被支原体污染是个世界性问题。国内外研究表明,95%以上的污染是由以下四个种支原体引起:口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)和菜氏无胆甾原体(A.laidlawii)。大约有二十多种支原体能污染细胞,有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染(某些支原体在人体是正常菌群)、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染等等。支原体大小介于细菌和病毒之间(最小直径0.2um),无细胞壁形态呈高度多形性,因此约有1%可通过滤菌器,过滤除菌不能够完全除去。支原体形态多变,在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构.其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似,但微绒毛电子密度比支原体小,且中央无颗粒群或中央束。支原体代谢需固醇类物质、部分种类需要精氨酸、O 2或葡萄糖,每一种支原体都有自身持点。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7.6—8.0),对酸耐受性差。对热比较敏感,对一般抗生素不敏感。支原体污染细胞后.培养液可不发生混浊.多数情况下细胞病理变化轻微或不显著,细微变化也可由于传代、换液而缓解.因此易被忽视。但个别严重者,可致细胞增殖缓慢.甚至从培养器皿脱落。为确定有无支原体污染可做如下检查:

(1)相差显微境检测:将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上,24h后取出,用相差油镜观察.支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。

(2)荧光染色法:荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258,可使支原体内含有的DNA着色,染色后用荧光显微镜观察。具体方法如下:首先将细胞接种盖玻片上,在细胞未长满前取出玻片,用不含酚红的 Hanks液漂洗一下,用l:3醋酸甲酵固定10Min,然后用生理盐水漂洗.置于用生理盐水配浓度为50pg/ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min.向细胞面滴加pH5.5磷酸缓冲液数滴,然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。

(3) 电镜检查;用扫描电镜方法简便快速.也可以利用透射电镜。

(4)支原体培养方法:检出率高.但方法较为复杂。

(5) PCR检测法:有现成的试剂盒买,可按说明书步骤操作,但假阳性和假阴性比例高,判断结果要慎重。


处理:

支原体污染细胞后,特别是重要的细胞株,有必要清除支原体,常用方法有:抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。要注意的是:支原体没有细胞壁,故作用于细胞壁生物合成的抗生素,如内酰胺类、万古霉素等是不敏感的;对多粘菌素、利福平、磺胺药物普遍耐火药。对支原体最有抑制活性抗生素是四环素类、大环内酯类等,氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小的抑制作用。目前最有效的支原体抗生素是M-PlasmocinInvivoGen公司),它能有效的杀灭大部分感染不太严重的支原体,而且又不影响细胞本身的代谢和生长,但是成本高,周期长,前后需要3个月左右。普通细胞不建议用此法,如果发现支原体感染最好的办法是高压灭菌后丢弃,重新到正规细胞库购买无支原体感染的细胞系。


细胞交叉污染

细胞交叉污染和细菌污染不同,细胞交叉污染是由于在培养过程中各种细胞同时进行,而所用器具或液体混杂使用所致。这种污染没有微生物存在,但使培养细胞不同种类之间发生混乱,细胞生长特性,形态发生变化。有些变化轻微,不易察觉,有些则可能由于污染的细胞具有生长优势而最终压过原来细胞而导致细胞生长的抑制,最终死亡。污染过的细胞由于种类不纯,无法进行实验研究。

防治及处理:1)在进行多个种类细胞培养操作时,所有器具要严格区分,最好作上标记以区分。对每一种细胞按顺序进行操作,避免一起操作时造成的混乱。(2)进行换液或传代操作时,注射器或滴管不要接触培养瓶瓶口,避免把细胞带到培养液瓶中。在进行其他细胞操作时导致细胞污染。(3)所有从别处转来的或是自己所建的细胞系都要早期留有的充足的冻存储备,一旦怀疑发生交叉污染,可做细胞遗传学方面的鉴定,如发现原有的细胞遗传物发生改变,可以复苏早期冻存的细胞使用或到正规细胞库购买